疾病相关microRNA研究策略及方法

近年来，研究还发现，miRNA分子同已知的循环核酸（DNA和RNA）一样，广泛存在于正常人和不同种病人的血清和血浆中，并且随着生理状况、疾病的类型和病程的不同而表达异常。随着循环miRNA的发现，人们对miRNA的兴趣日增，这么好的疾病诊断和预防标志物，岂能错过？但是如何开展miRNA研究呢？一般来说，通常是先开展miRNA表达谱分析，筛选出与特定生物学过程相关的miRNA。之后是miRNA靶基因验证并通过miRNA的过表达和沉默，进行miRNA的功能分析。

miRNA表达谱分析

miRNA分离纯化

包括经典的Trizol法提取总RNA和众多的商业化kit，比如miRNeasy Mini Kit – Qiagen, mirVana – Ambion，PureLink® miRNA Isolation Kit - Life Technologies，mirPremier™ - Sigma，High Pure miRNA Isolation Kit - Roche ，各有优劣，可根据样品类型选择。

RNA浓度纯度分析

常用生物实验技术原理汇总

一、GST pull-down实验
基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种"诱饵蛋白",目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的"捕获蛋白"(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,"诱饵蛋白"和"捕获蛋白"均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)

二、足印法（Footprinting）
足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。

三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）
染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别 反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。

四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术
基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作

SCI论文写作全攻略

第一部分   SCI论文全攻略之选题与创新

一、先想先写最后做

1. 做研究之前，必须想清楚：结果能不能发表？发表在哪里？

2. 先把文章大框写好，空出数据，等做完实验填完空就可以发了；正所谓心中有沟壑！

3. 在未搞清"写什么、发哪里、自己研究与同类研究有何出色之处"之前，就不要动手做！

4. 继续去看文献，去想；想不清楚就做还不如不做！

5. 要想这样做，就得先看文献！要知道如何把文章架起来、要知道别人是如何讨论的、要知道自己的数据是不是说明了与别人不同的事情或别人没有做过……这个过程就是阅读文献及思考的过程，这些搞清楚了，写就简单了！

6. 要是先做事，做完发现别人做过，或无法用理论来解释，岂不是冤大头？

二、如何科学选题

1. 课题选择和国际接轨。想在国际核心期刊发表文献，就必须了解国际研究动态，选择与国际学术研究合拍的课题。由于多方面因素的影响，我国科学研究选题与国际先进水平还有一定距离。我国一家权威科研机构不久前在国内挑选了许多前沿领域的研究课题，准备参与国际合作，但到美国后发现近三分之二的课题已经不属前沿，在美国很少有人研究。在高校，一些教师治学严谨、基础扎实，但科研成果不突出，重要原因就是不重视有关领域学术动态，不能选得合适的课题。

2. 课题要有可发展性。课题可发展性对高水平论文的持续产出具有极大作用。中国科技大学范洪义另辟蹊径，发展了诺贝尔奖得主狄拉克(Dirac)奠定的量子论的符号法，系统地建立了"有序算符内的积分理论"，1998年有24篇论文被SCI收录；他对自己论文高产的解释是，研究"具有开创性，突破一点以后就可以向纵深发展，使研究工作自成系列、成面成片"。我院被SCI收录论文最多的杨新民老师从事凸性理论研究，该理论兴起于 20世纪70年代，90年代进入高峰。作为新兴研究领域，该理论本身有许多尚待研究之处，同时该理论也可用来解决最优化方面的问题。反之，有人由于所接触的问题已处于该研究分支的末端，即使在该点上有所突破，也难持续发展。

撰写一篇完整的系统评价的步骤

       系统评价的方法是由英国著名流行病学家Archie Cochrane首先提出的，早在20世纪70年代他就倡导，临床医师需使用已被证明有明显效果的医疗保健措施以应付卫生资源的短缺。而临床随机对照试验所获取的结果是可靠的证据，他建议应当将特定病种、同种疗法的所有随机对照试验结果合并成为说服力比单个试验更强的证据，并在新的临床试验结果出现时予以更新，保证证据更加真实可靠。

　　疾病防治性系统评价是在筛选并严格评估相关研究的基础上，收集并合并数据，进而对某一防治性问题得出明确的结论。Meta-分析是整合数据的一种统计学方法。运用了Meta-分析的系统评价可以称为定量系统评价，未使用Meta-分析的系统评价为定性系统评价。

lncRNA研究思路和案例

长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA，它们本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。随着近年来lncRNA不断被发现，人们开始关注lncRNA在各种生物学过程以及疾病中所起到的作用。通过lncRNA芯片，研究人员能够快速高通量的获得与特定生物学过程或者疾病相关的lncRNA的表达变化。应用领域包括：发现与特定生物学过程相关的lncRNA和寻找与疾病相关的lncRNA等。

表观遗传学之甲基化研究

表观遗传学研究的是基因序列不发生改变的可遗传改变，这种可遗传改变调控基因表达变化，是基因表达转录调控的另一个层面。因此，DNA序列作用仅在于承载遗传信息，而表观遗传的机制对真核生物的发育却能起到调控的作用。

1994年，Holliday将表观遗传定义为不基于DNA序列的改变的细胞核遗传（Holliday 1994）。2006年，表观遗传被定义为染色质模板发生改变的总和，这些改变使得相同序列的基因组却呈现出不同的基因表达和沉默模式，并且这种改变能代代相传（Allis et.at. 2006）。

表观遗传的机制包括（但不限于）：DNA甲基化（胞嘧啶5’位碳的甲基化）、组蛋白的翻译后修饰、组蛋白的变异、染色质重塑（结构发生改变）、基因印记以及RNA干扰（非编码RNA或者基因沉默）等等（Jenuwein 2006）。

观察性临床研究（病例对照研究）遵循STROBE规范

STROBE声明针对case-control studies

	条目	Recommendation 建议
Title and abstract  题目与摘要	1	(a) Indicate the study’s design with a commonly used term in the title or the abstract 在题目或摘要中用常用术语表明研究所采用的设计
		(b) Provide in the abstract an informative and balanced summary of what was done and what was found 在摘要中对所做工作和获得的结果做一个简要的总结
Introduction 前言部分

microRNA检测技术

      MicroRNA(miRNA)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等。

    动植物miRNA略有不同，其miRNA的共同特征包括：长度短(17-25nt)，前体带有可预测的茎环结构，高度保守，高拷贝数，其表达具有组织（和发育阶段）特异性。每个miRNA可以控制多个基因，据估计，miRNA可调控近1/3的人类基因的表达。miRNA通过两种机制发挥作用：完全配对---mRNA被降解（常发生在植物中）；不完全配对---翻译被抑制，但mRNA保持完整（常发生在动物中）。