近年来，研究还发现，miRNA分子同已知的循环核酸（DNA和RNA）一样，广泛存在于正常人和不同种病人的血清和血浆中，并且随着生理状况、疾病的类型和病程的不同而表达异常。随着循环miRNA的发现，人们对miRNA的兴趣日增，这么好的疾病诊断和预防标志物，岂能错过？但是如何开展miRNA研究呢？一般来说，通常是先开展miRNA表达谱分析，筛选出与特定生物学过程相关的miRNA。之后是miRNA靶基因验证并通过miRNA的过表达和沉默，进行miRNA的功能分析。
miRNA表达谱分析
miRNA分离纯化
包括经典的Trizol法提取总RNA和众多的商业化kit，比如miRNeasy
Mini Kit – Qiagen, mirVana – Ambion，PureLink® miRNA
Isolation Kit - Life Technologies，mirPremier™
- Sigma，High Pure miRNA Isolation Kit - Roche ，各有优劣，可根据样品类型选择。
RNA浓度纯度分析
miRNA芯片分析
目前成熟的miRNA芯片分析平台主要有Agilent
miRNA芯片，Exqion LNA 芯片，Affymetrix GeneChip miRNA芯片，及 ABI的Taqman miRNA芯片
芯片数据验证
早期Northern blot，目前主流实时定量PCR。ABI 的Taqman assay
是目前最广泛的验证方法。
生物信息学分析
主要是利用网上免费的数据分析工具分析数据。包括靶基因预测，gene oncology 分析，pathway分析以及miRNA-mRNA整合分析等。
miRNA靶基因预测及验证
预测主要通过免费的在线分析工具，包括TargetScan，miRanda，PicTar，DIANA2MicroT等（参看相关blog）。
靶基因验证：双荧光报告基因系统
miRNA功能分析
若是在大规模图谱分析中发现了显著差异的miRNA，那么恭喜您，下一步可开展miRNA的功能验证了。miRNA的功能研究与基因相似，过表达和沉默是两种有力的方法。通过miRNA功能研究，您能够确定特定miRNA的目标和作用，分析单个miRNA失调的生物学意义。功能研究可利用miRNA Mimic、miRNA Inhibitor以及Target Protector来开展。
l 利用miRNA Mimic模拟内源miRNA的调控
l 利用miRNA
Inhibitor抑制内源miRNA
l 利用Target
Protector保护单个miRNA目标基因
miRNA Mimic模拟物
miRNA Mimic是合成的双链RNA，它们转染到细胞之后，模拟了天然存在的miRNA。在转染72小时之后，基因表达被有效抑制。在前面提到的前列腺癌研究中，Liang Wang等就利用了QIAGEN的双链miRNA mimics来研究miRNA的功能。1 他们发现，在7个差异表达的miRNA中，5个与细胞周期调控有关，而预计另2个（miR-145和miR-331-3p）靶定了20个枢纽基因中的3个。这两个miRNA的异位表达降低了目标枢纽基因的表达，随后导致细胞生长抑制和凋亡。
miRNAinhibitors抑制剂or Antogomirs
与miRNA Mimic不同，miRNA
Inhibitor是经过化学修饰的单链RNA，它们在转染后抑制miRNA的功能。这些抑制剂经过设计和修饰，确保内源miRNA功能的高效抑制。
选择性保护miRNA靶标
Target Protector是经过修饰的单链RNA，它特异干扰miRNA与单个靶标的相互作用，而不影响同一miRNA对其他靶标的调控。在转染之后，Target Protector与特异的miRNA结合位点结合，阻碍miRNA进入该位点，并防止基因下调。这时，可开展表型或基因表达分析。目标基因表达增加，信号模式的改变，或表型改变，都可提供线索，说明研究中的miRNA和靶标参与了您感兴趣的通路或表型。
miRNA研究和应用中科学家关注的主要科学问题以及目前常用的研究方法。
问题
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目的
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研究方法
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应用
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有哪些miRNA表达？
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miRNA表达情况
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深度测序&生物信息学分析
生物信息学分析预测可能的miRNA，进一步验证
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发现新的候选miRNA
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miRNA何时表达？在哪里表达？表达差异？
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miRNA表达特征
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miRNA芯片，磁珠流式细胞miRNA表达谱
qPCR对hit miRNA进行验证，Northern Blot，原位杂交等
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发现差异miRNA，为进一步功能研究、诊断，预后判断，疗效检测等奠定基础
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miRNA控制哪些基因？这些基因功能？所在信号通路？
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miRNA功能分析
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生物信息学分析
qPCR对hit mRNA进行验证，Western Blot等方法检测蛋白表达水平
转入miRNA mimics观察相应mRNA&蛋白水平变化以及相关现象（miRNA低表达情况）
转入miRNA antagomirs观察相应mRNA&蛋白水平变化以及相关现象（miRNA低表达情况）
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机理研究，功能研究
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miRNA如何控制靶miRNA
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确定结合位点
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生物信息学分析miRNA结合靶mRNA 3ˊUTR的可能序列
构建包含miRNA结合位点（3ˊUTR）以及位点突变的萤光素酶报告载体进行验证
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机理研究
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miRNA功能（与特定疾病、表型的关系）
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miRNA功能分析
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细胞水平：过表达及抑制实验（见前），观察表型及现象变化以及上下游通路变化
动物模型：过表达及抑制实验（见前），观察表型及现象变化以及上下游通路变化
临床组织样本，检测miRNA表达情况与疾病相关性
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功能研究
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miRNA应用于诊断
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诊断
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选择疾病相关的一个或一组miRNA，或结合其它基因水平变化，进行q-RCR等检测
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诊断，预后判断，疗效检测
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miRNA应用于治疗
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治疗
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转入合成的小分子miRNA模拟物（miRNA低表达情况）或拮抗剂（miRNAG高表达情况）
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治疗
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miRNA主要研究技术
深度测序 抽提分离小分子（例如18-30nt）RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（miRNA-cadidate new），并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA，为进一步的深入研究奠定基础。
miRNA芯片 利用miRNA芯片（例如Agilent
miRNA芯片），可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA在疾病发生中的作用。与深度测序不同，miRNA芯片针对已知miRNA进行研究。筛选到的差异miRNA可以利用q-pCR进行验证。
q-PCR q-PCR技术可以用来检测miRNA以及其靶mRNA和相关mRNA等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。
Mimics以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA研究也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics或拮抗miRNA 的antagomir，观察靶mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。
萤光素酶报告系统
在确定了靶mRNA之后，找到位于3ˊ-UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector系统），通过观察miRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。
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